Q，問題

A, 可能的原因和建議的解決方案

沒有提取到質(zhì)粒DNA或得率低

a) 培養(yǎng)方面: 溶氧量的問題，培養(yǎng)總體積不要過大，一般為培養(yǎng)瓶的20%體積，使用透氣性好的封瓶膜，轉(zhuǎn)數(shù)200rpm~250rpm。注意雜菌生長(zhǎng)問題，菌落是否正常生長(zhǎng)，抗生素不可忽略，培養(yǎng)基的PH=7.2 ，培養(yǎng)時(shí)間8~16H , 溫控在37°。

b) OD值對(duì)質(zhì)粒提取至關(guān)重要：最佳性能提取及最佳吸光值，細(xì)胞數(shù)量保持OD值=3~5，可選擇自然過夜培養(yǎng)的菌液，稀釋十倍，或自行稀釋最佳性能的OD值。

c) 菌量較多，不完全裂解：過多的細(xì)胞數(shù)會(huì)導(dǎo)致裂解及中和的不完全，直觀表現(xiàn)為：①加P2后液相渾濁，不清澈透明；②加P3中和，離心后液相渾濁，中和不徹底，過濾注射器會(huì)堵塞。③加質(zhì)粒結(jié)合液后液相渾濁，核酸結(jié)合柱會(huì)堵塞。影響得率以及濃度；(不同的菌種的生長(zhǎng)條件，對(duì)堿性裂解敏感性有所不同，可適當(dāng)調(diào)整裂解條件)

d) 不完全中和，P3的重要性：中和狀態(tài)不應(yīng)該是糊狀及結(jié)團(tuán)狀，應(yīng)該是蓬松，應(yīng)是質(zhì)地較輕漂浮到液面頂端，冰上孵育體系輔助中和，中和完全可有效去除基因組DNA，并提高得率，過得菌量并不能帶來(lái)更多的質(zhì)粒DNA并且會(huì)造成提取過程當(dāng)中不必要的麻煩.

.P3加入后，中和離心后所剩液相體積與質(zhì)粒結(jié)合液最佳比例體積,參考第9頁(yè)。

e) 質(zhì)粒DNA洗滌液2：確保在質(zhì)粒洗滌液2中加入了正確體積的乙醇。此外，確保每次使用后瓶蓋擰緊，以防止乙醇蒸發(fā)

Q，問題

A, 可能的原因和建議的解決方案

RNA的殘留

a)過多的細(xì)胞數(shù)量會(huì)導(dǎo)致RNA殘留過多，使得Rnase A 的酶達(dá)到極值，不能消化掉更多的RNA殘留。RNA殘留過多影響核酸濃度值，使得數(shù)據(jù)不準(zhǔn)確。解決辦法為降低菌液量，嚴(yán)格按照標(biāo)注的OD值進(jìn)行操作，或調(diào)高Rnase A的濃度（菌種本身RNA含量高）。

b)P1中的Rnase A 降解，Rnase A溶解在P1后，確保P1長(zhǎng)期存儲(chǔ)在4°C，隨用隨取。。如果確定溶液P1中的RNase A失活，在溶液P1中補(bǔ)加RNase A（終濃度≥100μg/ml）即可；RNase A可以單獨(dú)購(gòu)買。

內(nèi)毒素量超標(biāo)

過多的細(xì)胞數(shù)量會(huì)導(dǎo)致內(nèi)毒素過多，使得內(nèi)毒素去除柱的能力達(dá)到極值，不能去除更多的內(nèi)毒素量，解決辦法為更換一個(gè)全新的內(nèi)毒素去除柱重復(fù)過柱一次。

質(zhì)粒DNA電泳質(zhì)量

a)電泳點(diǎn)樣孔異常亮：質(zhì)粒中污染了細(xì)菌基因組DNA , 多是由于P2加入后震蕩過于劇烈，導(dǎo)致基因組DNA剪切或放置時(shí)間過長(zhǎng)導(dǎo)致的

b) 質(zhì)粒DNA條帶下方500bp左右有條帶或者熒光團(tuán)的存在

為RNA殘留，需調(diào)整參與提取的菌液濃度，或者調(diào)整Rnase A 的濃度；

電泳條帶不完整，渙散，不干凈

前兩孔為雜菌DNA污染，裂解不充分，洗滌液性能衰退。

后兩孔為正常質(zhì)粒提取，濃度及純度達(dá)到性能標(biāo)準(zhǔn)，條帶完整無(wú)基因組DNA和RNA污染，無(wú)降解。

組件名稱

貨號(hào)

規(guī)格

儲(chǔ)存條件

RNase A

（液體10mg/ml）

TE1008-1

1ml

4℃/-20℃

TE1008-0.6

0.6ml

4℃/-20℃

TE1008-0.3

0.3ml

4℃/-20℃

P1

TD4200-1-150

150ml

室溫

TD4200-1-210

210ml

室溫

TD4200-1-410

410ml

室溫

P2

TD4200-2-150

150ml

室溫

TD4200-2-210

210ml

室溫

TD4200-2-410

410ml

室溫

P3（結(jié)合）

TD4200-3-150

150ml

室溫

TD4200-3-210

210ml

室溫

TD4200-3-410

410ml

室溫

質(zhì)粒DNA洗滌液1

TD4200-5-55

55ml

室溫

質(zhì)粒DNA洗滌液2（未加乙醇）

TD4200-6-23

23ml

室溫

質(zhì)粒DNA洗脫液

TD4200-7-10

10ml

室溫

TD4200-7-20

20ml

室溫

TD4200-7-30

30ml

室溫

5號(hào)柱PX套裝

TC1082-5

5個(gè)

室溫

注射器內(nèi)芯-過濾器-X

TC1037-5

5個(gè)

室溫

注射器外套

TC1092-5

5個(gè)

室溫

內(nèi)毒素去除柱

TC1051-10

10個(gè)

室溫

收集管

TC1001-50

50個(gè)

室溫

TC1001-200

200個(gè)

室溫